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威尼斯wnsr888实验方案|在流体环境下细胞培养进行粘附实验

date:2022-06-29 14:53:13

  该应用描述了一种在流动下的粘附试验,该试验旨在研究特定细胞表面分子的作用,以确定它们在细胞附着和粘附到其他细胞类型期间的潜在相互作用。

 

  对于我们的方法,我们使用预染色的鼠肿瘤细胞(多发性骨髓瘤:MM)和鼠内皮细胞(EC),然后使用单克隆抗体阻断我们感兴趣的分子之一。简而言之,将EC接种到威尼斯wnsr888通道μ-SlidesI0.6mmLuer中,并在恒流下培养24小时。为了开始共培养,将标记的MM细胞添加到流动容器中并继续流动。24小时后,用抗体(以阻断感兴趣的分子)或相应的同种型对照处理装置,并保持流动24小时。第二天,将μ-Slides与流体单元(FU)断开并清洗以去除非粘附的MM细胞。为了分析标记的MM细胞对EC的粘附,使用共聚焦显微镜获得了μ-Slides的荧光图像。

 

  1. 材料和试剂

 

  •MOPC多发性骨髓瘤(MM)细胞系(ATCC,TIB-23™)

 

  •EOMA内皮细胞(EC)系(ATCC,CRL-2586™)

 

  •含10%FCS的RPMI培养基(FisherScientific,11530586)

 

  •内皮细胞生长培养基(EC培养基、CellBiologics、M1168)

 

  •PBS(泛生物技术,P04-361000)

 

  •非酶细胞解离溶液(Sigma-Aldrich,C5914-100ML)

 

  •台盼蓝溶液(Sigma-Aldrich,93595)

 

  •CellTracker™绿色CMFDA染料(ThermoFisher,C7025)

 

  2. 设备和设置

 

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  •带有2个流体单元(FU)的威尼斯wnsr888泵系统,每个单元都带有用于2ml储液罐的支架(威尼斯wnsr888,10977)

 

  •威尼斯wnsr888μ-SlideI0.6mmLuer,ibiTreat(威尼斯wnsr888,80186)

 

  •威尼斯wnsr888PerfusionSet蓝色,15厘米,内径0.8毫米(威尼斯wnsr888,10961)

 

  •威尼斯wnsr888过滤器/储液罐套装,2毫升(威尼斯wnsr888,10972)

 

  •带细胞培养设备的层流罩

 

  •培养箱(所有培养步骤均在37°C和5%CO2下进行)

 

  •带有适当滤光片组和照相机的荧光显微镜

 

  •粘度:0.0072(dynxs)/cm²

 

  3.实验流程

 

  1.准备EOMA细胞稀释液:根据制造商的说明,使用非酶细胞解离溶液分离先前培养的EOMA细胞。使用血细胞计数器(Neubauerchamber)对细胞进行计数。在EC培养基中将细胞稀释至1.2x106个细胞/ml的浓度。

 

  2.种入EOMA细胞:在3个 µ-SlidesI0.6mmLuer(威尼斯wnsr888,80186)中加入150µlEOMA细胞稀释液(每个µ-Slide1.75x105EOMA细胞),然后孵育3小时。

 

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表1:实验设置

 

  3.启动流量:播种三小时后,将2个µ-Slides连接到流体单元FU,使用总量2.7毫升EC培养基。在8.2mbar的压力下将EOMA细胞表面的剪切应力设置为0.5dyn/cm²。测量流速并使用两个FU的平均值来计算校准因子。提前孵育FU和连接的载玻片过夜。第三个带有EOMA细胞的µ-Slide用作静态控制。在没有任何流动的情况下孵育它过夜。

 

  4.准备MM细胞:根据制造商的方案,用CellTrackerGreen(CMFDA)染料在600µlRPMI培养基(不含FCS)中染色6x105MM细胞。标记后,离心细胞并使用血细胞计数器对其进行计数。

 

  5.开始与MM细胞共培养:停止流动并在无菌条件下从FU水库中取出EC培养基。要开始共培养,将RPMI培养基(含10%FCS)和EC培养基以1:1的比例混合,并填充该混合物总体积为2.5ml,其中含有1.5x105MM注入两个FU储液罐。将FU重新连接到泵系统并继续流动24小时。

 

  6.分子阻断:将MM细胞添加到ECs后24小时,用100µg/ml抗体(载玻片 #2)或相应的同种型对照(载玻片 #1)处理细胞,将它们直接添加到FU,无需更换介质。将孵育保持在流动状态下24小时。

 

  7.清洗和成像:从FU上断开µ-Slides。用PBS清洗细胞一次,以去除任何非贴壁细胞。使用共聚焦显微镜获取荧光图像,以可视化附着在EC层上的标记MM细胞。

 

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图1:与同种型对照处理(左图)相比,阻断特定表面分子(右图)时,MM细胞对ECs的粘附性降低

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